Biologie Moleculară. Metode experimentale

Marius Mihăşan, Marius Ştefan, Zenovia Olteanu

Descriere Sumar Despre autori

Cartea este ghid detaliat al unor metode de cercetare utilizate frecvent în biologia moleculară, concentrându-se nu numai pe simpla formulare a unor protocoale experimentale, ci şi pe explicarea principiilor din spatele fiecărei metode în scopul precizării spectrului de aplicabilitate şi a rezultatelor scontate.

Introducere I. Tehnici de bază utilizate în laboratorul de biologie moleculară I.1 Sticlăria şi instrumentele din materiale plastice Siliconarea sticlăriei şi a instrumentelor din materiale plastice Spălarea şi uscarea vaselor de laborator I.2 Măsurarea volumelor Măsurarea volumelor cu ajutorul pipetelor I.3 Măsurarea maselor Instrucţiuni privind utilizarea balanţei electronice analitice I.4 Centrifugarea Instrucţiuni privind utilizarea centrifugii I.5 Tehnici de bază folosite pentru manipularea microorganismelor Măsuri de biosecuritate Tehnici de sterilizare II. Metode de cultivare a bacteriei Escherichia coli II. 1 Medii utilizate pentru cultivarea bacteriei Escherichia coli Medii de cultură minimale Medii de cultură complexe Medii de cultură solide Medii minimale solide Medii de cultură complexe solide Agar de acoperire Agar de conservare prin înţepare Antibiotice utilizate la prepararea mediilor de cultură II. 2 Cultivarea E. coli pe medii solide Însămânţarea la suprafaţa mediilor de cultură solide Însămânţarea în profunzime a mediilor de cultură solide II. 3 Cultivarea E. coli în medii lichide Inocularea şi cultivarea folosind volume mici de mediu Inocularea şi cultivarea folosind volume mari de mediu II.4 Monitorizarea creşterii bacteriei E. coli în mediile lichide Determinarea densităţii optice cu ajutorul spectrofotometrului Determinarea densităţii optice cu ajutorul hemocitometrului Determinarea numărului de bacterii prin cultivare în plăci Petri II. 5 Păstrarea culturilor de E. coli Păstrarea prin congelare la -80oC III. Plasmide şi tulpini de Escherichia coli utilizate frecvent în biologia moleculară III.1 Vectori plasmidiali utilizaţi frecvent în ingineria genetică Principalele caracteristici ale vectorilor plasmidiali utilizaţi în ingineria genetică Vectorul pUC19c Vectorul pBlueScript II SK (+/–) Vectorul pET-21a Vectorul pMAL-c5x III.2 Tulpini de Escherichia coli utilizate frecvent în ingineria genetică IV. Metode Şi tehnici folosite pentru izolarea Şi purificarea ADN-ului IV.1 Izolarea ADN-ului plasmidial Izolarea ADN-ului plasmidial folosind metoda lizei alcaline Izolarea ADN-ului plasmidial utilizând metoda lizei prin fierbere IV.2 Izolarea ADN-ului genomic Izolarea ADN-ului genomic din bacterii Izolarea ADN-ului genomic din plante Izolarea ADN-ului din ţesuturi animale IV. 3 Purificarea ADN-ului din soluţii apoase IV. 4 Izolarea ADN-ului din geluri de agaroză IV. 5 Păstrarea ADN-ului purificat V. Amplificarea enzimatică in vitro a acizilor nucleici V.1 Amplificarea enzimatică in vitro a ADN-ului sau PCR Amplificarea enzimatică in vitro a fragmentelor de ADN de până la 4 kb V.2 Criterii pentru alegerea oligonucleotidelor amorsă (primer) VI. Determinarea concentraţiei acizilor nucleici în soluţie V.1 Determinarea concentraţiei acizilor nucleici prin spectroscopie UV - VIS Determinarea concentraţiei acizilor nucleici prin spectroscopie UV V.2. Determinarea concentraţiei acizilor nucleici prin fluorimetrie Determinarea concentraţiei acizilor nucleici folosind bromura de etidiuDeterminarea concentraţiei acizilor nucleici folosind metoda cu folie din plastic Determinarea cantităţii de ADN pe geluri de agaroză VII. Separarea electroforetică a ADN-ului VII. 1 Electroforeza clasică în geluri de agaroză VII. 2. Separarea ADN prin electroforeză în gel de poliacrilamidă cu gradient de agent denaturant VII.3 Detecţia ADN-ului în geluri de agaroză Detecţia ADN-ului folosind bromura de etidiu Detecţia ADN-ului în geluri de agaroză folosind coloranţi de tip SYBR Detecţia ADN-ului în geluri de agaroză folosind albastrul de metilen Viii. Purificarea proteinelor prin cromatografie de afinitate faţă de metale VIII.1 Strategii de clonare a genelor în vectori de expresie VIII.2 Identificarea condiţiilor optime de supraexpresie a proteinelor recombinate VIII.3 Purificarea prin IMAC a proteinelor recombinate în condiţii native VIII.4 Purificarea prin IMAC a proteinelor recombinate în condiţii denaturante VIII. 5 Determinarea maselor moleculare native utilizând cromatografia de filtrare prin gel (GF) Determinarea maselor moleculare native utilizând cromatografia de filtrare prin gel Calibrarea coloanei de GF şi calcularea maselor molare IX. Determinarea concentraţiei proteinelor IX.1 Determinarea concentraţiei proteinelor prin spectroscopie UV IX.2 Metode colorimetrice de determinare a concentraţiei proteinelor Error! Bookmark not defined. Metoda Lowry Metoda Bradford Micrometoda Bradford de dozare a concentraţiei proteinelor Metoda cu acid bicinchoninic (BCA) Micrometoda BCA de dozare a proteinelor Macrometoda BCA de dozare a proteinelor IX.3 Realizarea curbelor de etalonare şi prelucrarea datelor X. Separarea electroforetică a proteinelor X.1 Electroforeza nativă a proteinelor în sistem discontinuu X.2 Electroforeza proteinelor în condiţii denaturante (SDS-PAGE) X.3 Detectia proteinelor separate prin electroforeza pe geluri de poliacrilamidă Colorarea gelurilor de poliacrilamidă în vederea evidenţierii proteinelor Colorarea cu Comassie Brilliant Blue R-250 Colorarea cu argint a gelurilor de poliacrilamidă X.4 Fotografierea gelurilor şi analiza imaginilor. Stabilirea masei moleculare relative XI. Evidentierea imunologică a proteinelor – Tehnica Western-Blot XI.1 Obţinerea anticorpilor policlonali. Tehnici de imunizare Obţinerea anticorpilor policlonali folosind adjuvantul Freund XI.2 Imunobloting-ul Electro-transferul proteinelor pe membrane în sistem semi-uscat Imunodetecţia proteinelor transferate pe membrane de nitroceluloză XII. Metode computaţionale de studiu a proteinelor XII.1 Fişiere FASTA şi operaţii simple cu secvenţe XII.2 Baze de date cu informaţii despre proteine Baze de date cu secvenţe proteice Baze de date cu structuri proteice XII. 3 Identificarea funcţiei proteinelor necunoscute cu ajutorul programului BLAST XII.4 Modelarea computaţională a structurii tridimensionale a proteinelor Programe, servere şi metaservere Aplicaţii ale metodelor de modelare a structurilor tridimensionale a proteinelor XII.5 Modelarea computaţională a complecşilor liganzi-proteine Problematica andocării moleculare Evaluarea rezultatelor obţinute prin andocare moleculară computerizată Aplicaţii ale andocării moleculare Anexă

Marius Mihăşan (n. 1981) este asistent universitar doctor la Universitatea "Alexandru Ioan Cuza" din Iaşi, Facultatea de Biologie. A publicat şi "Megaplasmidul pAO1 - structură şi funcţie", Editura Universităţii "Alexandru Ioan Cuza" din Iaşi, 2011.
Marius Ştefan (n. 1977) este şef lucrări doctor la Universitatea "Alexandru Ioan Cuza" din Iaşi, Facultatea de Biologie. A mai publicat, între altele, "Biologia microorganismelor rizosferice – aplicaţii biotehnologice", 2008.
Zenovia Olteanu (n. 1952) este conferenţiar universitar doctor la Universitatea "Alexandru Ioan Cuza" din Iaşi, Facultatea de Biologie. A mai publicat, între altele, "Elemente de chimie generală", 2007.